荧光测定需要单色性较高的激发光，通常会在光束进入样品之前经单色器分光，保留所感兴趣的激发波长或波段。

较常见的单色器为棱镜或是光栅，在一些简易的荧光系统中也可使用滤波片。在该系统中，由激发光源发出的光经激发单色器分光获得特定波长的激发光，然后射入样品池，激发荧光物质的荧光发射。

荧光分光光度计与荧光光度计的区别在于两者之间的分光系统，前者可以采用色散型单色器，可对入射和发射光波长进行选择，可进行入射/ 发射波长扫描，多见于大型通用仪器；后者采用滤光片，具有固定的光谱通带，一般用于专用仪器中。